免疫组织化学( Immunohistochemistry，IHC )或免疫细胞化学( Immunocytochemistry，ICC )利用抗原与抗体特异性结合的原理，

通过化学反应使标记抗体显色确定组织细胞内抗原，原位定性、定位或定量研究组织切片或细胞标本中某些多肽或蛋白质等大分子物质的实验技术。

总体来说，IHC的实验流程和方法并不难，但要获得干净的染色结果并不容易，IHC实验中有许多细节也值得关注。

那么，详细情况主要是哪个？ 听我说一下。

1

标本的固定

固定化是用化学试剂处理组织和细胞，目的是使细胞内的蛋白质凝固，减少或终止内源性或外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，并保存组织和细胞内的抗原性，避免抗原失活、分散。

好的固定剂渗透性强其次不能使组织过度收缩变形； 需要赋予组织一定的硬度，使其具有良好的折射率。

固定剂种类繁多，如无水酒精有利于糖原的保存，易使细胞收缩，其性能与95%酒精相似，很少单独使用，一般只用于固定糖原的抗原不同，对固定液的耐受性也不同。

丙酮是易挥发的无色液体，有刺激性气体。

能沉淀蛋白质，渗透性强，细胞收缩剧烈，固核差异广泛用于酶组织化学中各种酶的固定，用于抗原的保存，也有人将其作为细胞涂层免疫组化的固定液。

此外，苦味酸对头皮、指甲固定有软化效果，戊二醛常用于电镜标本固定，使用浓度为2.5%，PLP固定液更好保存含糖组织抗原等，对特定组织效果更好。

如上所述，需要根据实际情况选择合适的固定剂。

目前常用的固定剂为中性甲醛液、4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液。

多聚甲醛固定效果温和，广泛应用于免疫组织化学研究。

甲醛可以固体形式存在，即白色粉末状的多聚甲醛。

将多聚甲醛溶解在PB中，加热到60，加热搅拌至液体透明。

固定方法多种多样，常用的有渗透法、灌流法、原位法、微滴法、蒸汽法、微波法等，其中以渗透固定和灌流固定效果最好。

灌注固定中灌注针置入主动脉内是灌注固定的关键和难点。

首先准确地找到主动脉是这一步的要点。

用温生理盐水冲洗干净胸腔内的血液，用眼科镊子轻轻夹住心外膜将心脏抬高至左上，即可看到主动脉，便于将灌流针插入主动脉内。

慢慢插入，避免刺入右心房，针尖方向不偏向右侧，感到阻力时，后退针，调整方向重新插入，直到进入主动脉，灌流针进入主动脉后，在心脏上方可以看到其位置。 灌流针进入主动脉的长度宜为3-5mm。

网上有很多方法可以学习网站。 在这里推荐。

Journal of Visualized Experiments :

https://www.jove.com

Bio-protocol :

https://bio-protocol.org

国家协议：

https://www.nature.com/nprot/

Protocol-online:

http://www.protocol-online.org/

2

脱水、石蜡包埋、制片人

脱水是指用脱水剂置换组织中的水分，使标本内处于无水状态。 具体而言，用梯度乙醇(从低到高)充分脱水。 一些容易变脆的组织也应该减少在高浓度酒精中的停留时间，减少变透明的时间。

组织浸渍蜡时，通常选择熔点为56-58的石蜡。 石蜡液与标本的比例应该为1，浸蜡温度最好不要超过60，防止抗原损失。

包埋是指将渗入石蜡的组织块置入包埋铸型中，包埋应选择角度快速动作，使其在切片时有完整的切面。

切片时，宜快则快，慢则慢，及时检查刀刃有无缺口，避免新刃划伤蜡带。

包埋后需要快速冷却，使标本和石蜡在短时间内凝聚成密度一致的一体。

3

脱蜡水合

切片分别在二甲苯中脱去组织中石蜡10-15分钟，使组织恢复固定后正常状态露出抗原，便于与抗结合。

脱蜡水合衰竭时，易发生局灶性反应和浸泡冲洗衰竭，出现非特异性背景着色。

脱蜡效果主要取决于切片厚度、二甲苯温度、脱蜡时间或移至恒温槽加热脱蜡。

水化的目的是冲洗溶解的石蜡和二甲苯。

二甲苯是非水溶液的有机溶剂，组织中进入的二甲苯与水溶性染色液不相容。 需用梯度乙醇逐步置换组织中的二甲苯，使标本切片从无水状态顺利进入染色液中进行染色反应。

4

抗原修复

抗原修复是指暴露抗原封闭或掩盖的表位，恢复原空间状态，提高抗原阳性检出率的过程。

组织在固定甲醛或多聚甲醛的过程中，发生了蛋白间的交联和醛基的封闭作用，决定隐藏抗原进行抗原修复，使细胞内抗原决定族再次暴露，提高抗原检出率。

常用的修复方法由强到弱一般可分为三种：高压加热修复、微波修复、胰蛋白酶修复。

其中高压加热修复方法简便易操作，效果也较好。

胰酶消化修复法主要用于细胞内抗原修复。

用0.1%氯化钙制成0.05%-0.1%胰蛋白酶液，37孵育15-30分钟，陈片应适当延长时间。

高压加热修复对掌握修复温度和时间很重要，温度越高修复时间越短，温度与修复时间呈负相关。

修复结束后注意室温冷却，使蛋白质自然恢复。

其次，尽量使用过量的抗原修复液，防止高温液体挥发干涸，对切片造成不可逆的损伤。

5

灭活内源性过氧化物酶和生物素

在传统的亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法和链霉亲和素-过氧化物酶法中，免疫组化反应容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活和封闭。

灭活内源性过氧化物酶一般用3%过氧化氢灭活约10分钟左右，用甲醇配制过氧化氢更适合于保护抗原和固定组织。

6

血清封闭

与免疫荧光技术一样，使用10%与第二抗体同种属都的正常血清进行封闭，目的为了防止一抗与组织的非特异性结合，造成假阳性。

7

一抗和二抗浓度和孵育时间

不同的一抗浓度根据抗体说明书而定，孵育时间和温度等对染色结果往往有着较大的影响。

在4下，反应缓慢，背景较浅，推荐使用。

二抗一般室温孵育30分钟。

如何选择一抗呢？

在此给大家推荐一个好的人类蛋白图谱，网站为https://www.proteinatlas.org/。

网站界面如下：

The Human protein atlas数据库免费提供全部24,000种人类蛋白质的组织和细胞分布信息，快来看看你要研究的蛋白在哪个器官富集，在哪个细胞定位吧！

实验难做很大程度上是总找不到好用的抗体，文献用得很好的经典抗体如何查找？

给大家介绍一个好用的抗体查找网站：https://www.citeab.com/search 。

可从181多家供应商中搜索4014509万种抗体；其次CiteAb按照引文数量对试剂进行排名方便我们查找最优抗体；CiteAb网站不仅可以查询抗体也可以查找化学试剂；CiteAb网站列出了引用抗体对应的文献，

举个例子，搜索Iba1：

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可以选择单克隆或多克隆抗体、抗性、应用、物种反应性等进行优化筛选：

CiteAb网站根据引文数量对抗体进行了排序，Abcam的Iba1抗体引文高达286，其次是Proteintech公司：

点击

可查看使用该抗体的文献：

希望CiteAb网站会成为我们的科研小助手。

8

切片清洗

PBS洗涤是为了去除未反应的抗体和其他杂物，以减少非特异性反应引起的背景着色和杂物污染，因此应该充分洗涤，特别是一抗孵育后。

一般使用PBS洗涤3次，每次5分钟。

9

DAB显色

DAB显色液终产物为棕黄色或棕褐色，为免疫组化最常见的的显色液。

DAB显色的棕黄色色原稳定性好，不溶于有机溶剂，可长期保存而不褪色。

背景的深浅和特异性染色的深浅都可以由DAB孵育条件决定。

DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而背景着色较浅时即可冲洗。

DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就立即出现很深的棕褐色，这可能说明一抗浓度过高，需要适当下调抗体浓度；若很短时间就出现深背景，有可能非特异性蛋白封闭不全，

需要延长封闭时间；DAB显色时间很长(如超过10分钟)才出现阳性染色，可能是一抗体浓度过低或者封闭时间过长。

贴片后梯度酒精脱水透明中性树脂封片后拍片即可。

10

免疫组化图片分析

安装方法：

IHC Profiler插件使用方法：

由文献可知，胞浆着色的IHC图片读入图片后可快速得到自动评分结果：

对于细胞核着色的IHC图片：

计算Score的公式为：

Score有四个等级，分别为4/3/2/1，High Positve为4分，Positive为3分，Low Positive为2分，negative 为1分。

软件实操如下：

1、 打开Imagej软件，软件界面如下：

File，Open，打开胞浆着色的图片：

询问是否是胞浆着色，下拉可选择核着色，此处选择胞浆着色，点击OK，进入以下界面，选择H DAB点击OK。

得到结果为High Positive：

而对于胞核着色，操作略微不同：

1、 打开Imagej软件，打开胞核着色图片：

同上选择H DAB，点击OK

进入以下界面：

调节Threshold阈值选中所有核着色，点击Plugins，选择IHC Profiler Macro，得到结果：

投稿邮箱：tougao@helixlife.com.cn